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植物的器官培养

发布日期:2019-10-13 22:49   来源:未知   阅读:
 

  第六章 植物的器官培养 【学习目的要求】 1.一般掌握离体根培养的取材部位和培养基的选择。 2.掌握茎尖培养的种类和操作步骤。 3.掌握茎段培养中材料的选择、处理及培养基的调 整。 4.掌握离体叶片的培养步骤。 5.一般掌握胚胎培养的类型与各自的注意事项。 6.掌握如何防止培养过程中外植体的褐化和玻璃化。 7.掌握植物器官组织培养常见问题的原因及对策 【主要内容】 第一节 营养器官培养 一、离体根培养 二、茎尖培养 三、茎段培养 四、离体叶培养 第二节 生殖器官培养 一、花器官和种子培养 二、胚胎培 三、胚珠培养 第三节 植物器官组织培养常见问题及对策 第一节 一、离体根培养 营养器官培养 ㈠ 离体根培养特点:因为根系生长快,? 代谢强,变异小,加上无菌, 不受微生物干扰,可根据研究需要,? 改变培养的成分来研究其 营养吸收、生长和代谢的变化。 ㈡ 应用:研究根系生理和代谢变化;也可由根细胞再生成植株,不 仅证明根细胞的全能性,也产生了无性繁殖系,用于生产实践 。 一、离体根培养 ㈢ 培养方法: 1.培养基 用无机离子浓度低的White培养 基,也可用MS、B5等,但浓度为2/3或1/2。 White培养基配方为:硝酸钾80,硫酸镁720, 硫酸锰7,硫酸铜0.03,碘化钾0.75, Vpp0.5,VB6 0.1,VB1 0.1,甘氨酸3(mg/L) 一、离体根培养 2.无性系的建立和培养、应用 1)将种子进行表面消毒,在无菌条件下用湿布培养萌发,至根伸长1.0cm以上。 2)从根尖一端切取长1.2cm的尖端,接种于培养基中。3)培养物生长甚快,? 几天后发育 出侧根。待侧根生长约一周后,即切取侧根的根尖进行接种培养,如此反复,得到 离体根的无性系。 4)这种根可用来进行根系生理生化和代谢方面的实验研究。如营养选择吸收、根尖伸长 生长、生长素对伸长的影响等 5)培养条件为暗光、25~27℃。 3.植株再生培养 第一步诱导形成愈伤组织。? 第二步在再分化培养基上诱导芽的分化、 再分化成小植株。 二、 茎尖培养 ㈠ 概念:是切取茎尖部分或茎尖分生组织部分,进行培养的过程。 这是组织培养中用得较多的外植体。因为茎尖分生区是三个分 区的主要部分。 ㈡ 茎尖培养可分为微茎尖培养和普通茎尖培养。 1.微茎尖:指带有1-2个叶原基的生长锥,其长度不超过0.5mm。 2.普通茎尖:指取几mm到几十mm长的顶芽尖及侧芽尖。这里主要介 绍后者 ㈢ 特点:技术简单,? 操作方便,易成活和分化,成苗时间短。 ㈣ 步骤如下: 1.取材:挑选洁净、无污染,生长不久的茎,从植物的茎、藤或匍匐枝 上切取2cm以上的顶梢。? 木本植物可事先对茎尖喷几次灭菌药剂。? 用 于普通茎尖培养。 2.消毒 将采到的茎尖切成0.5~1.0cm长,并将大叶除去,休眠芽预先 剥除鳞片。? 将茎尖置于流水冲洗干净,再在95%的酒精中处理30秒, 然后在稀释20倍的次氯酸钠中浸5~8分钟,最后用无菌水冲洗数次, 沥干后准备接种。 3.? 接种 为了减少污染,在接种前再剥掉一些幼叶,使茎尖为0.5cm大小 左右。? 用作快速繁殖。 注意:一要防褐化。接种时,不用锈刀,动作敏捷,? 随切随接,用 1~5%VC液浸泡处理。二要防干燥 4.培养 (1)培养基:? 采用MS培养基或略加修改,或补加其它物 质。也可用其它培养基如White,Heller等。 培养基中生长素是必须的,如2,4-D,IAA,? NAA等,但 是浓度不能太高,一般用0.1mg/L左右,若高易产生畸 形芽或形成愈伤组织。 (2)培养问题处理: 茎尖在培养过程中会出现生长太慢、? 生长太快和 生长正常等三种类型。 I 生长太慢:接种后茎尖不增大,只是茎尖逐渐 变绿,出现绿色小点,细胞逐渐老化而进入休 眠状态,? 或者逐渐变褐死亡。引起原因的是生 长素浓度太低,或是温度过低或过高。 (2)培养问题处理: II 生长太快型:是接种后茎尖迅速增大,在茎 尖基部产生愈伤组织,? 并迅速增殖,而茎尖 不伸长,久之茎尖也形成愈伤组织,从而丧 失发育成苗的能力。引起原因一是生长素浓 度过高,引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织 的形成。? 二是光照太弱或温度太高。 (2)培养问题处理: III 生长正常型是接种后茎尖基部稍增大并形成 少量愈伤组织,? 茎尖颜色逐渐变绿,并逐渐 伸长,叶原基发育成可见的小叶,进而形成 小苗。 (3)培养条件: ? 培养时每天光照可长一些,最长达16h/d,照度 1500-3000Lx,温度25±2℃。并且根据不同植物种 类,? 或者随培养过程的不同,给予适当的昼夜温 差等处理。 ? 注意:防培养基干燥,由于茎尖培养时间较长,通 过定期转移、严加封口等。? 一般茎尖培养在40 天左右可直接长成新梢。 (4)继代培养 用茎段切割法。? 继代培养可用MS0培养基。或用生长物质较 低的MS培养基。 也可边增殖边生根培养 (5)诱导生根 I) 用1/2 MS培养基, ? 并只加入生长素类调节物质, 如NAA 、IBA等。注意浓度 II)也可将切下的新梢基部浸入50或100ppm的IBA溶液 处理4~8小时,然后转移到无激素的生根培养基中。 III)注意较高浓度的生长素对生根有抑制作用。 5.移栽驯化 ⑴ 指标:发现新梢基部生有较浓密的不定根,生长健壮而发达, 长度在1cm以内。 ⑵ 移栽:可先进行几天炼苗程,? 取出→洗培养基→栽入驯化器 皿—基质蛭石:珍珠岩:草炭土为1:1:0.5。 ⑶ 栽后管理:1)初期保持湿度。上合峰会将青岛推向世界夜游经济的机会? 基质浇透水,床面浇湿,? 搭小拱 棚等,并且初期要常喷雾处理。 ? 2)后期逐渐减少湿度。拱棚两端打开通风,减少喷水次数。? 以 后揭去拱棚,并控制水分。 ⑷ 温度管理上要掌握适宜的生根温度,最适宜的温度是16~20℃, 春季地温较低时,可用电热线来加温。 光照:初期弱光照,加盖遮阳网或报纸等,后期可直接利用自 然光照。 移栽前的工作 ? (1)培养瓶生壮苗 加入生长控制剂,如多效唑, B9, CCC,其 作用是使苗粗壮,叶绿素增加。 (2)炼苗 将瓶盖打开,打破无菌环境,湿度逐渐下降,光照逐 渐加强,使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时 间为10—30D。 移栽时应注意的问题 (1)防止菌类滋生 ①苗底部培养基要洗干净 ②杀菌剂处理苗的根部 ③定时用杀菌剂处理种植基质 常用杀菌剂:KMnO4、百菌清、多菌灵、托 不津,使用浓度0.1% (2)保持小苗水分供给平衡 (3)移栽时选择合理的种植基质 基质要疏松透气,有适宜的保水性,易于 灭菌处理,不利于杂菌滋生:常用珍珠岩,椰 糠,蛭石,细沙,泥炭。 泥炭 珍珠岩 椰糠 (4)注意一定光照,温度条件 一般强度较高的慢射光较好 三、 茎段培养 概念:指不带芽和带1个以上定芽的,包括块茎、 球茎在内的幼茎切段的无菌培养。 培养目的:快速繁殖。也可研究茎细胞的生理, 以及筛选突变体育种。 快繁优点:培养技术简单易行,繁殖速度较快;? 芽生芽方式增殖的苗木质量好,且无病,性状 均一;解决不能用种子繁殖植物的快速繁殖问 题等。 1.材料选择和处理 取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘,木本则取当年生嫩枝或一年 生枝条,? 剪去叶片,剪成3~4cm的小段。 注意:1)尽力取顶部茎切段和顶芽,? 但由于顶芽少可利用腋芽,但 尽力用茎上部的腋芽。? 2)尽量在生长期取芽,休眠期成活率降低。如苹果在3~6月取 材的成活率为60%,7~11月下降到10%,12~2月都在10%以下。 1.材料选择和处理 在自来水中冲洗1~3小时,? 用75%酒精 灭菌30~60秒,? 再用0.1%升汞浸泡3~8分 钟,? 或用饱和漂白粉浸泡10~20分钟,因 材料老嫩和蜡质多少而定时间。? 最后用无 菌水冲洗数次,以备接种。 2.培养过程 ? 培养选MS培养基,加入3%蔗糖,用0.7%的琼脂固化。? 培养条件保持25℃左右,给予充分的光照和光期。 ? 培养物的变化:1)基部切口上长出愈伤组织,呈现稍 许增大,控制不要过大。2)而芽开始长长,有时会出 现丛生芽,培养方式或是培养出芽梢或是培养芽丛,从 而得到无菌苗。 ? 培养基:促进腋芽增殖用6-BA是最为有效的,依次为Kt 和Zt等。生长素虽不能促进腋芽增殖,但可改善苗的生 长,也要适量加入。GA对芽伸长有促进作用。 2.培养过程 ? 继代扩繁:包括二种途径,一是促进腋芽的快速生长;? 二是诱导 形成大量不定芽。第一种途径的好处是不会产生变异,? 能保持品 种优良特性。且方法简便,可在各种植物上使用,每年从一个芽 可增殖10万株以上。第二种途径虽会产生变异,繁殖系数较高, 适于多数植物。 ? 生根培养和移栽驯化与茎尖培养相似,不再重复。 ? 同样注意驯化管理。要进行炼苗,小心移栽,初期湿度要大,基 质通气湿润,保湿保温,特别要精心管理等。 四、 离体叶培养 ? 离体叶培养:包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子 叶在内的叶组织的无菌培养。? 它大多经脱分化形成 愈伤组织,再经再分化生出不定芽和不定根。 ? 应用:不仅可用于研究形态建成、? 光合作用、叶绿 素形成等理论问题,而且也是繁殖稀有名贵品种的 有效手段 四、 离体叶培养 ? 叶培养特点:材料来源广泛,数量大,容易培养,尤其对木本 植物,生成的愈伤组织完整,数量多,较迅速等。 ? 叶片再生能力: ? 以羊齿植物最多,双子叶植物次之,单子叶 植物最少。 ? 再生方式:? 一种是直接诱导形成不定芽,另一种是先诱导形成 愈伤组织,再经愈伤组织分化成植株。 叶的离体培养技术如下: 1.材料选择及灭菌 选择健康洁净的植株,取其 较幼嫩叶片,冲洗干净,用70%酒精漂洗约10秒, 再在饱和漂白粉液中浸3~15分钟,或在0.1%升汞 中浸3~5分钟,以前者为佳。用无菌水冲洗数次,? 再放在无菌的干滤纸上吸干水分,以供接种用。对 一些粗糙或带茸毛的叶片要延长灭菌时间。注意要 选择成熟的叶片。 叶的离体培养技术如下: 2.接种 将叶片切成约0.5cm见方小块或圆 片及薄片(如叶柄和子叶),注意选择切块 位置。MS培养基附加BA 1~3,NAA0.25~1。 3.培养 培养条件为每天10~12小时光照, ? 光强1500~3000Lx。 3.培养 1)? 培养2-4周,叶切块开始增厚肿大,进 而形成愈伤组织。 ? 2)转移到分化培养基上进行培养,其培养 基的BA含量为2左右,约再过10天左右,愈 伤组织开始转绿出现绿色芽点,? 形成不定 芽。通过继代培养和生根培养,完成整个组 培过程。 3.培养 ? 叶的培养比胚,茎尖和茎段培养难度大。首 先要选用易培养成功的叶组织,? 如幼叶比成 熟叶易培养,子叶比叶片易培养。其次要添 加适当的生长素和细胞分裂素浓度,保证利 于叶组织的脱分化和再分化。 第二节 生殖器官培养 一、 花器官和种子培养 (一)花器官培养 花器官培养: 指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、 花柄、子房、花药等的无菌培养。子房和花药培养另有专门叙 述。 应用:理论上通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在 花芽性别决定中所起的作用。? 可以了解花器各部分对果实和种 子发育的作用,? 以及内、外源激素在果实种子发育过程中的调 控作用。生产上可用于珍贵品种的扩大繁殖。 培养方法如下: 1.取材 从健壮植株上取未开放的花蕾,已经开 花的不宜用,因为消毒困难。? 先用75%酒精消毒约 30秒钟,再用饱和漂白粉浸10~15分钟,取出用无 菌水冲洗数次。 2.接种培养 用整个花蕾培养时,只要把花梗插 入培养基中。若用花器,? 则分别取下切成小片。 2.接种培养 I) 培养基: MS、? B5等。若让花器官育成小植株,要用诱导培养基, 加入生长激素和细胞分裂素,先形成愈伤组织或胚状体,? 再分化 培养成植株。如菊花的花瓣片接在含6-BA 2mg/L、? NAA 0.2的MS 培养基上,形成少量愈伤组织。再经1个月就分化出绿色芽点,再 切割转接,可形成大量无根苗,用于繁殖。 II) 26℃ 1500Lx光照,每天光照10小时,? 培养约2周 (二)种子培养 ? 种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成 熟种子的无菌培养。这项技术广泛地应用于花卉、蔬菜、果树、 农作物等的种子培养之中。 ? 优点:可以打破种子休眠,特别对一些休眠期长的植物;? 可以 作为大量生产试管苗的好材料,它分化容易,? 无菌操作方便。 可使远缘杂交产生的杂种败育种子,正常萌发产生第二代植株。 培养技术如下: 1.种子灭菌 种皮厚或不饱满的种子,宜用 0.1%升汞消毒10~20分钟。幼嫩的或发育不 全的种子,宜用饱和漂白粉消毒15~30分钟。 若种子上有绒毛或蜡质,应先用95%酒精或 吐温40处理,提高消毒效果。对壳厚难萌发 的种子,可去壳培养。 培养技术如下: 2.培养基 若以种子萌发为目的,培养基可不加或少加生长 激素。对某些发育不全的无胚乳的种子培养,应提供适 当的生长激素。种子培养的糖浓度可稍低,一般1~3%。 3.接种培养 排列, 种子培养的接种较容易,每瓶3~5粒,? 均匀 4.培养条件:20~28℃,1000~2000Lx光强,每天光照10小 时 二、 胚胎培养 ? 胚及胚器官(如子房、? 胚珠)在离体无菌条件下,使胚发育成幼 苗的技术。? 包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、 胚乳培养等。 ? 胚胎培养史:已有近百年,? 1904年的Haning首次培养了萝卜和辣 椒的胚,并萌发形成小苗。30年代把兰科植物的胚培养成小植株。 40年代进行苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大 白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养。 (一)胚胎培养的意义 1.克服远缘杂种的不育性 用胚胎培养和试管受精技术,解决种间 和属间胚败育,? 胚发育不全,而不能正常萌发的问题。 2.使胚发育不全的植物获得后代。? 如兰花、天麻的种子成熟时,胚 只有6~7个细胞,多数胚不能成活。分离出这此些未成熟胚进 行培养,得到正常植物。 3.缩短育种年限 应用胚培养技术可以缩短育种周期1~2年。 (二)离体胚培养 ? 胚发育过程:受精→受精卵→合子→第一次 分裂→分生组织和幼胚→成熟胚。在这个过 程,胚靠消耗胚乳的营养而发育,? 同时胚 处在胚囊环境中,可吸收氨基酸、维生素等 营养。 离体胚培养包括成熟胚和幼胚培养 1.成熟胚培养 指子叶期后至发育完全的胚。? 培养较易成功,在含有无机大量元素和糖的培养基上,就能 正常生长成幼苗。将成熟或未成熟种子→70%酒精表面消毒→无 菌水冲洗3~4次→无菌条件下进行解剖,取出胚并接种在适当 的培养上培养。 2.幼胚培养 幼胚是指子叶期以前的幼小胚? ,现在可对心形期胚 或更早期(0.1~0.2mm)的胚进行培养。胚越小就越难培养,现 在大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等幼胚已培养成功。 I)操作方法 ? 与成熟胚培养基本相同,? 切取幼胚必须在高 倍解剖镜下进行,? 操作时要特别细心,尽量 取出完整的胚。 II)培养方式 常见有三种明显不同的生长方式: 第一种是继续进行正常的胚胎发育,? 维持“胚性生长”; 第二种是在培养后迅速萌发成幼苗,? 而不继续进行胚性生 长,通常称为“早熟萌发”; 第三种是发生细胞增殖形成愈伤组织,并由此再分化形成 多个胚状体或芽原基。? 特别是加有生长调节剂时,就 更为如此。 III)影响因素 1.?培养基 成熟胚对培养基要求不高,而幼胚要求较高,常用的培养 基有Tukey、MS、B5、Nitsch培养基,其中前者适于成熟胚 培养,其它适于未成熟胚和幼胚培养。 幼胚需要较高的蔗糖浓度,? 提供较高的渗透压。由于幼胚在 自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳,? 具有较高的渗透压, 人工培养基中要创造高渗透压的条件,? 它可以调节胚的生长,阻 止可能的渗透压影响,? 还能抑制早熟萌发中的细胞延长,以及抑 制胚的萌发,避免把细胞的伸长状态转化为分裂状态。 III)影响因素 2.生长调节物质 不同植物的胚培养需要的生长物质不同,如IAA可明显促 进向日葵胚的生长。IAA,Kt的共同作用可促进荠菜幼胚的生长。一般认 为IAA可使胚的长度增加;加入BA可提高胚的生存机会。 3.天然提取物 椰乳对胚培养有一定的促进作用,如番茄胚在含有50%椰乳的 培养基中可维持生长。瓜类的胚乳提取物也能促进胚生长的能力,可能 是植物激素的细胞分裂物质和一些有机氮化合物作用的结果。 4.温光条件 大多数植物的胚在25~30℃为宜,但是,早熟果树(如桃)必须 经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长。 光照可以促进某些植物 的胚转绿,? 利于胚芽生长,而黑暗利于胚根生长。因此以光暗交替培养 较为有利。 5.? 其它条件 胚培养中还要求较高浓度的氨基酸及无机盐。 三、胚珠培养 ? 概念:在无菌条件下对授粉的子房取出胚珠 进行培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一 起取下来培养。 ? 优点:胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚 较小不易培养的问题。另一方面在未受精的 胚珠培养中,可诱发大孢子发育成单倍体, 用于单倍体育种。 三、胚珠培养 ? 接种和培养基:从花中取出子房进行表面消毒,在无菌 条件下进行解剖,取出胚珠,放在培养基上培养;多用 Nistch培养基,也可采用MS、N6、B5等培养基。 ? 注意:关键是选择胚的发育时期,实验证明发育到球形 胚期的胚珠较易培养成功。另外可取用带胎座甚至带部 分子房的胚珠进行培养。 四、胚乳培养 ? 概念:指对由两个单倍的极核和一个单倍的精子结 合而成的三倍体组织的培养。可获得无子结实的三 倍体植株,进而可将它加倍成六倍体植株。 ? 接种和培养基 :取授粉4~8天后的幼果,常规消 毒后,在无菌条件下切开果实,取出种子,小心分 离出胚乳。接种在培养基上; 培养过程: I)接入MS、White等培养基,附加2,4-D或NAA 0.5~2.0,BA0.1~ 1.0。在25~27℃和黑暗条件或散射光下培养,约6-10天胚乳开 始膨大,形成愈伤组织; II)转入分化培养基,MS培养基附加0.5~3.0 mg/l的BA及少量的NAA。 使愈伤组织长出芽。 III)切下不定芽,插入生根培养基中,光下培养10~15天,切口处可 长出白色的不定根。 第三节 植物器官组织培养常见问题及对策 一、污染及控制 1、污染的含义: 指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑,使培养材料不能正常生长发 育,从而导致培养失败的现象。 2、污染原因(从病原菌分析) (1)细菌污染:菌斑呈黏粘液状,界限比较明显,一般接种后1—2天 即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。 (2)真菌污染:菌斑呈绒毛状、絮状,界限不明显,伴有不同颜色的 孢子接种后3—10天才能发现。主要是霉菌污染。 3、污染途径 (1)外植体带菌 (2)培养基及接种器具灭菌不彻底 (3)接种操作时带入 (4)环境不清洁 4、污染的预防措施 A、 防止外植体带菌 (1) 选择好外植体采集时期和采集部位 ● 外植体采集以春秋为宜; ● 优先选择地上部分作为外植体; ● 阴雨天勿采,晴天下午采集; ● 采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。 (2)室内或无菌条件下进行预培养。 (3)外植体严格灭菌 灭菌效果实验 多次灭菌和交 替灭菌 B、保证培养基及接种器具彻底灭菌 1、分装时,注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口 2、检查封口膜是否破损 3、扎瓶口要位置适当,松紧适宜 4、保证灭菌时间和高压锅内温度 5、接种工具用前彻底灭菌 6、工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌 C、操作人员严格遵守无菌操作规程 D、 保证接种与培养环境清洁 (1)污染瓶经高压灭菌后再清洗 (2)接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射,或用臭 氧灭菌机消毒 (3)定期清洗或更换超净台初过滤器,进行带菌实 验;接种前15—20min打开风机,风速调整到20—— 30m/min,并对台面用75%酒精喷雾消毒 (4)定期对培养室消毒,防止高温 二、培养物的不良表现及改进措施 (一)初始培养阶段 1.培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯 可能原因:表面杀菌剂过量,消毒时间过长,外植体选用不当(部位或时 期)。 改进措施:调换其他杀菌剂或降低浓度,缩短消毒时间,试用其他部位,生 长初期取材。 2.培养物长期培养几乎无反应 可能原因:基本培养基不适宜,生长素不当或用量不足,温度不适宜。 改进措施:更换基本培养基或调整培养基成分,尤其是调整盐离子浓度,增加生长素用 量,试用2,4-D,调整培养温度。 (一)初始培养阶段 3.愈伤组织生长过旺、疏松,后期水浸状 可能原因:激素过量,温度偏高,无机盐含量不当。 改进措施:减少激素用量,适当降低培养温度,调整无机盐(尤其是 铵盐)含量,适当提高琼脂用量增加培养基硬度。 4.愈伤组织太紧密、平滑或突起,粗厚,生长缓慢 可能原因:细胞分裂素用量过多,糖浓度过高,生长素过量。 改进措施:减少细胞分裂素用量,调整细胞分裂素与生长素比例,降 低糖浓度。 (一)初始培养阶段 5.侧芽不萌发,皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织 可能原因:枝条过嫩,生长素、细胞分裂素用量过多。 改进措施:减少激素用量,采用较老化枝条。 6、初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后,其表面开始褐化,有时甚至会使整个培养 基褐化的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活, 而使细胞的代谢发生变化所致。 在褐变过程中,会产生醌类物质,它们多呈棕褐色,当扩散到培养基 后,就会抑制其他酶的活性,从而影响所接种外植体的培养。 (1)褐变的主要原因如下 ①植物品种 研究表明,在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化 酶,而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此,在培养过程 中应该有所选择,对不同的品种分别进行处理。 ②生理状态 由于外植体的生理状态不同,所以在接种后褐变程度也有所不 同。一般来说,处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅,而从已经成年的 植株采收的外植体,由于含醌类物质较多,因此褐变较为严重。一般来 说,幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显,而老熟的组织在接种后褐 变程度较为严重。 ③培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加,此外, 细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性,从而 使褐变现象加深。 ④培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等,均可使多酚 氧化酶的活性提高,从而加速被培养的外植体的褐变程度。 (2)减轻褐变现象发生的方法 ①选择合适的外植体 一般来说,最好选择生长处于旺盛的外植体,这 样可以使褐变现象明显减轻。 ②合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、及时继代培养均 可以减轻材料的褐变现象。 ③使用抗氧化剂 半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏 血酸等。该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。用经过滤灭菌的药 液洗涤刚切割的外植体伤口表面,或加入固体培养基的表层,或将 刚切割的外植体浸入其中一定时间。另外,使用0.1%-0.5%的活性炭 对防止褐变也有较为明显的效果。PVP处理。 ④连续转移 对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后,再转移到新的 培养基上,这样经过连续处理7-l0d后,褐变现象便会得到控制或大 为减轻。 (二)继代培养阶段 1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高 可能原因:细胞分裂素用量不足,温度偏高,光照不足。 改进措施:增加细胞分裂素用量,适当降低温度,改善光照, 改单芽继代为团块(丛芽)继代。 2.苗分化过多,生长慢,有畸形苗,节间极短,苗丛密集,微 型化。 可能原因:细胞分裂素用量过多,温度不适宜。 改进措施:减少或停用细胞分裂素一段时间,调节温度。 (二)继代培养阶段 3.分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化 可能原因:生长素用量偏高,温度偏高。 改进措施:减少生长素用量,适当降温。 4.叶粗厚变脆 可能原因:生长素用量偏高,或兼有细胞分裂素用量偏高。 改进措施:适当减少激素用量,避免叶片接触培养基 5.再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来 可能原因:细胞分裂素用量偏高,或表明该种植物适于该种再生方式。 改进措施:适当减少细胞分裂素用量,或分阶段地利用这一再生方式 (二)继代培养阶段 6.丛生苗过于细弱,不适于生根或移栽 可能原因:细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当,温度过高,光照短,光 强不足,久不转移,生长空间窄。 改进措施:减少细胞分裂素用量,免用赤霉素,延长光照时间,增强光照, 及时转接,降低接种密度。 7.幼苗淡绿,部分失绿 可能原因:无机盐含量不足,PH值不适宜,铁、锰、镁等缺少或比例失调, 光照、温度不适。 改进措施:针对营养元素亏缺情况调整培养基,调好PH值,调控温度、光照。 8.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中 可能原因:瓶内气体状况恶化,PH值变化过大,久不转接导致糖已耗尽,营 养元素亏缺失调,温度不适,激素配比不当、缺铁等。 改进措施:及时转接、降低接种密度,调整激素配比和营养元素浓度,改善 瓶内气体状况,控制温度。 (二)继代培养阶段 9、继代培养时材料的玻璃 实践表明,当植物材料不断地进行离体繁殖时,有些培养物的嫩茎、 叶片往往会呈半透明水渍状,这种现象通常称为玻璃化。它的出 现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的 生理失调症。 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根,因此,使繁殖系数大为降低。 在不同的种类、品种间,试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培 养基上细胞分裂素水平较高时,也容易出现玻璃化现象。在培养 基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质,能够在一定程度上减轻 玻璃化的现象发生。 (二)继代培养阶段 呈现玻璃化的试管苗,其茎、叶表面无蜡质, 体内的极性化合物水平较高,细胞持水力差, 植株蒸腾作用强,无法进行正常移栽。这种 情况主要是由于培养容器中空气湿度过高, 透气性较差造成的, 其具体解决的方法为 ①增加培养基中的溶质水平,以降低培养基的水势; ②减少培养基中含氮化合物的用量; ③增加光照; ④增加容器通风,最好进行CO2施肥,这对减轻试管苗玻璃化的现象有明 显的作用; ⑤降低培养温度,进行变温培养,有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生; ⑥降低培养基中细胞分裂素含量,可以考虑加入适量脱落酸。 两个“增加”:增加琼脂浓度;增加蔗糖含量;两个“增强”:增强溶 器通风;增强光照;两个“加入”:加入渗透剂;加入ABA; 一个 “减少”:减少培养基氮含量 (三)生根阶段 1、培养物久不生根,基部切口没有适宜的愈伤组织 可能原因:生长素种类、用量不适宜;生根部位氧气不良;生根程序不当; PH值不适,无机盐浓度及配比不当。 改进措施:改进培养程序,选用适宜的生长素或增加生长素用量,适当降 低无机盐浓度,改用滤纸桥液培养生根等。 2.愈伤组织生长过快、过大,根茎部肿胀或畸形,几条根并联或愈合。 可能原因:生长素种类不适,用量过高,或伴有细胞分裂素用量过高,生 根诱导培养程序不对。 改进措施:调换生长素种类或几种生长素配合使用,降低使用浓度,减少 愈伤,改变生根培养程序等。 【本章小结】 1.器官培养应用范围最广泛。它是指植物离体的根、茎、 叶、花、果和种子的无菌培养。 2.根培养主要研究根的生理代谢。 3.花培养包括整个花器官或花的组成部分之一的无菌培养, 基本培养基一般用MS或B5。 4.种子无菌培养操作简便,植株分化容易,可以一定程度 上克服育种上远缘杂交的不育性。 5.胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房 培养和胚乳培养等。具有以下意义:(1)克服远缘杂种 的不育性,(2)使胚胎发育不完全的植株获得后代, (3)缩短育种年限,提高育种效率。 【本章小结】 6.器官培养应用:不仅是研究器官生长、? 营养代谢、生理 生化、组织分化和形态建成的最好材料和方法,而且在 生产实践上具有重要的应用价值,? 如利用茎、叶和花 器培养建立的试管苗,? 可在短期内提高繁殖速率,进 行名贵品种的快速繁殖;利用茎尖培养可得到脱毒试管 苗,? 解决品种的退化问题,提高产量和质量;将植物 器官作诱变处理,用器官培养可得到突变株,进行细胞 突变育种。 7.植物器官组织培养常见问题的原因及对策。 【思考题】 1.为什么说植物器官培养是组织培养的一个最重要的方面?器官培养包 括哪些类型? 2.植物的离体根培养有何意义? 3.普通茎尖培养时,怎样取材和处理外植体?茎尖培养过程中会出现什 么现象?怎样解决? 4.茎段培养与茎尖培养有什么主要区别? 5.花器官培养通常指花的哪些部分培养?常用的基本培养基是什么? 6.植物胚胎培养分为哪些类型?各有何特点和要求?胚胎培养有何重要 意义? 7.如何防止培养过程中外植体的褐化和玻璃化?